原标题：Nature | 空间蛋白组学数据重分析证实Y染色体缺失对膀胱癌免疫治疗有效性影响

Y染色体对男性的性别决定和精子形成至关重要。随着于测序技术的进步和CRISPR介导的整个Y染色体的敲除实验的开展，研究人员开始表征Y染色体在各种生理环境中的功能。其中多项研究表明，在老年男性中Y染色体缺失（LOY）与许多疾病有关。例如，造血细胞中的LOY与一些疾病的风险增加有关，包括心脏纤维化和多种癌症类型。在膀胱癌中，10-40%的肿瘤中发现了LOY。膀胱癌通常是由烟草和工业化学品的环境暴露引起的，并会导致DNA损伤和LOY。

文章摘要

23年6月，来自美国西达赛奈医学中心 (Cedars-Sinai Me早孕检查dical Center) 癌症中心主任、医学博士Dan Theodorescu及俄亥俄州立大学综合癌症中心- James癌症医院和Solove研究所Zihai Li博士团队在《Nature》上发表文章“Y chromosome loss in cancer drives growth by evasion of adaptive immunity”，揭示了癌症中Y染色体的丢失通过逃避适应性免疫驱动肿瘤的生长。

他们利用CRISPR-Cas9对自然发生的LOY突变膀胱癌细胞以及Y染色体靶向缺失的膀胱癌细胞进行了深入的研究。Y阳性(Y+)和Y阴性(Y -)肿瘤在体外生长相似，而Y-肿瘤在免疫活性宿早孕检查主中以T细胞依赖的方式展现出比Y+肿瘤更具侵袭性。研究发现，Y-肿瘤促进肿瘤微环境中CD8+ T细胞的显著功能障碍或耗竭。

这些发现通过单核RNA测序和人类膀胱癌的PhenoCycler空间蛋白质组学评估得到了验证。同时，与Y+肿瘤相比，在小鼠模型和癌症患者中，Y-肿瘤对抗PD -1免疫检查点阻断治疗的反应增加。因此研究人员认为，具有LOY突变的癌细胞能够改变T细胞功能，促进T细胞衰竭并使其对PD-1靶向免疫治疗敏感。这项工作为了解LOY突变的生物学基础和成为改善癌症免疫治疗的潜在生物标志物提供了新的视角。

研究结果

1. LOY与患者不良预后相关

研究人员基于在正常膀胱尿路上皮中表达的18个Y编码基早孕检查因创建了Y染色体RNA表达特征评分。使用该评分对癌症基因组图谱(TCGA)转录组数据中300名局部晚期肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)患者的总生存率进行了分层，将这些患者分为Y染色体高评分组和低评分组。Y染色体基因表达评分低的患者总生存率明显低于Y染色体基因表达评分高的患者(P = 0.024)。

此外，研究人员发现四个Y染色体基因(KDM5D、UTY(也称为KDM6C)、TBL1Y和ZFY)的个体表达降低也与预后不良有关。

图1 TCGA数据库中Y染色体评分结果和生存期的相关性

2. 建立小鼠膀胱癌LOY模型评估其对肿瘤生长的影响

研究人员使用MB49，一种被广泛使用的LOY膀胱癌细胞系Y−。同时建立了早孕检查不存在LOY的阳性对照细胞系Y+。将两个细胞系注入具有免疫能力的野生型雄性C57BL/6小鼠，Y−小鼠的肿瘤生长速度是Y+的两倍。随后，研究人员用CRISPR-Cas9技术构建了LOY的MB49细胞系，该细胞系注入小鼠后肿瘤增长速度快于阳性对照细胞系。但在Rag2−/−Il2rg−/−免疫缺陷型小鼠（T细胞，B细胞和自然杀伤性细胞缺陷）中则没有这种差异。

研究人员还将Y+和 Y−细胞系中与膀胱癌预后较差相关的KDM5D 和 UTY基因进行敲除或过表达。与野生型的Y+肿瘤相比，敲除KDM5D 或 UTY的Y+肿瘤的生长速度增加，但在Rag2−/−Il2rg−/−小鼠中没有观察到这种差异。在Y -肿早孕检查瘤中过表达KDM5D 或 UTY导致野生型小鼠肿瘤生长下降，但在Rag2 – / – Il2rg – / -小鼠中没有。

这些结果表明，KDM5D和UTY至少在一定程度上导致Y-肿瘤的抗肿瘤免疫受损。此外，人类肿瘤中KDM5D或UTY缺失的鉴定有可能成为确定膀胱癌临床侵袭性的有用预后因素。

3. LOY肿瘤细胞创造了免疫抑制的肿瘤微环境

对Y+和 Y−细胞系进行转录组测序，测序结果表明与Y -肿瘤相比，Y+肿瘤中的免疫反应增强。此外，在B细胞缺陷的小鼠中Y-肿瘤细胞仍然增长的更快，说明LOY对肿瘤微环境的影响可能与内源性抗肿瘤T细胞免疫。

研究人员使用高维光谱流式细胞术来描绘Y+和Y-肿瘤之间瘤内CD早孕检查45+免疫细胞群的差异。Y -肿瘤中总CD8+ T细胞和免疫抑制(CD11b+F4/80+LY6C−CD206+)表型巨噬细胞富集，并且PD-L1+CD45+免疫细胞百分比和PD-L1表达水平升高。研究者在CRISPR Y-Scr和CRISPR Y-KO MB49肿瘤中观察到类似的结果，CRISPR Y-KO肿瘤含有更大比例的CD8+ T细胞以及免疫抑制性CD206+PD-L1+巨噬细胞。

空间蛋白质组学分析结果与这些发现一致，在Y−MB49组织切片中也观察到F4/80+巨噬细胞数量增加和PD-1/PD-L1表达增加。TCGA中膀胱癌数据分析结果与Y -和Y+ MB49细胞的比较类似，Ylow肿早孕检查瘤中的CD8+ T细胞表现出免疫检查点分子的表达增加，如CD274(编码PD-L1)， LAG3和HAVCR2(编码TIM3)，以及祖T细胞(TCF7)和终端耗竭T细胞(TOX)的标。这些结果表明，Ylow膀胱癌含有更高比例的耗竭和祖耗竭CD8+ T细胞，以及调节T细胞。

为了进一步验证snRNA-seq结果并从组织学上评估T细胞衰竭水平，研究人员评估了来自患者匹配样本的PhenoCycler单细胞原位空间蛋白组学的免疫微环境结果。与流式细胞术和snRNA-seq分析结果一致，Ylow膀胱癌含有更高比例的功能失调CD8+ T细胞。并且与YHigh膀胱癌样本相比，Ylow肿瘤中CD8+ T细胞的比早孕检查例更高，但在Ylow肿瘤的所有肿瘤内T细胞亚群中，包括CD8+ T细胞(原生样、早期激活、耗竭、祖细胞耗竭和效应记忆)和CD4+ T细胞(T调节性、原生样、T滤泡辅助和T辅助1细胞)，TOX表达更高。总之，LOY肿瘤促进TME中CD8+ T细胞衰竭。

图2 PhenoCycler与单细胞测序结果显示Yhigh与Ylow组细胞构成差异

4. LOY肿瘤对抗PD-1/PD-L1治疗的响应

既往研究表明，TME中耗竭和祖耗竭CD8+ T细胞的增加与抗PD-1/PD-L1治疗后改善有关。研究人员用抗PD-1阻断抗体处理Y+和Y- MB49细胞系，以及CRISPR Y- scr和CRISPR Y- ko MB早孕检查49细胞系。在治疗过程结束时，用流式细胞术检测肿瘤浸润CD8+ T细胞在有和没有免疫治疗的情况下的动态变化。与Y+肿瘤相比，克隆选择和CRISPR生成的Y -肿瘤模型对抗PD-1治疗的反应都有所改善。这同人类snRNA-seq数据的分析结果一致，同型对照抗体处理的Y -肿瘤的CD8+ T细胞y与Y+肿瘤相比，显示出更多的耗竭标志物，如TOX和TIM3的表达。Y -肿瘤的CD8+ T细胞对抗PD-1处理表现出从更耗竭(表达TIM3, LAG3和TOX)到更激活(表达CD44, ICOS但不表达TOX)分化状态的表型变化。而Y+肿瘤的侵袭性较弱，在肿瘤生长的早期阶段最为明显，这可能是由于在肿瘤初期早孕检查淋巴细胞更活跃，这种现象同样可以在RNA和蛋白质水平上看到，这可能是Y+肿瘤对抗PD-1治疗反应不佳的原因。

在大型临床实验（IMvigor210）中同样可以观察到Y+和 Y−患者对抗PD-L1治疗响应的差异 Ylow患者PD-L1表达水平更高，肿瘤新抗原负荷（TNB）也更高。与LOY肿瘤促进TME中CD8+ T细胞耗竭一致，Y -肿瘤对抗PD-1 免疫抑制剂治疗更敏感。

图3 Y+与Y-组接受免疫治疗响应结果的差异，这种差异与LOY肿瘤促进TME中CD8+ T细胞耗竭有关

结论

本文重新分析了2021年发表在《Nature Communications》上的文章“An N-cadherin 2 ex早孕检查pressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery, chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer”中的PhenoCycler数据，并基于文本的研究目的——Y染色体缺失对肿瘤免疫微环境的影响对其进行重分析，展示了PhenoCycler单细胞原位空间蛋白组学数据结果中蕴含的丰富信息可多次重复利用。客户可对数据结果根据不同角度进行多次挖掘，发现新的视角或验证新的猜想。

参考文献

1. Abdel-Hafiz HA, et. Y chromosome loss in c早孕检查ancer drives growth by evasion of adaptive immunity. Nature. 2023 Jul;619(7970):624-631. doi: 10.1038/s41586-023-06234-x. Epub 2023 Jun 21.

2. Gouin, K. H. 3rd et al. An N-cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery, chemotherapy and immunotherapy in bladder cance早孕检查r. Nat. Commun. 12, 4906 (2021).

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